Ilon zahari tarkibida karboksil ester aloqalarini gidrolizlovchi fermentlar mavjud.Gidroliz uchun substratlar fosfolipidlar, atsetilxolin va aromatik asetatdir.Bu fermentlar uch turni o'z ichiga oladi: fosfolipaza, asetilkolinesteraza va aromatik esteraza.Ilon zahari tarkibidagi arginin esteraza sintetik arginin yoki lizinni ham gidrolizlashi mumkin, lekin u asosan tabiatdagi oqsil peptid aloqalarini gidrolizlaydi, shuning uchun u proteazaga tegishli.Bu yerda muhokama qilingan fermentlar faqat ester substratlariga ta'sir qiladi va hech qanday peptid bog'lanishiga ta'sir qila olmaydi.Bu fermentlar orasida atsetilxolinesteraza va fosfolipazaning biologik funktsiyalari muhimroq bo'lib, ular to'liq o'rganilgan.Ba'zi ilon zaharlari kuchli aromatik esteraza faolligiga ega, ular p-nitrofenil etil ester, a - yoki P-naftalin asetat va indol etil esterni gidrolizlashi mumkin.Bu faollik mustaqil ferment yoki karboksilesterazaning ma'lum yon ta'siri tomonidan ishlab chiqarilganmi yoki uning biologik ahamiyati haqida hali noma'lum.Agkistrodon halys Japonicus zahari p-nitrofenil etil ester va indol etil efir bilan reaksiyaga kirishganda, p-nitrofenol va indol fenolning gidrolizatlari topilmadi;Aksincha, bu efirlar kobra Chjoushan kenja turi ilon zahari va Bungarus multicinctus ilon zahari bilan reaksiyaga kirishsa, ular tezda gidrolizlanadi.Ma'lumki, bu kobra zaharlari kuchli xolinesteraza faolligiga ega, bu yuqoridagi substratlarning gidrolizlanishi uchun javobgar bo'lishi mumkin.Aslida, Mclean va boshqalar.(1971) kobra oilasiga mansub ko'plab ilon zaharlari indol etil ester, naftalin etil ester va butil naftalin esterini gidrolizlashi mumkinligini xabar qildi.Bu ilon zaharlari quyidagilardan kelib chiqadi: kobra, qora bo'yinli kobra, qora labli kobra, oltin kobra, Misr kobra, qirol kobra, oltin kobra mamba, qora mamba va oq labli mamba (D. aw haligacha sharqiy rombola chig'anoqli ilonini biladi.
Ilon zahari qon zardobidagi xolinesteraza faolligini aniqlash uchun substrat bo'lgan metilindol etil esterni gidrolizlashi mumkin, ammo bu ilon zahari xolinesteraza faolligini ko'rsatmaydi.Bu kobra zaharida xolinesterazadan farq qiladigan noma'lum esteraza borligini ko'rsatadi.Ushbu fermentning tabiatini tushunish uchun keyingi ajratish ishlari kerak.
1, fosfolipaza A2
(I) Umumiy ko'rinish
Fosfolipaza glitseril fosfatni gidrolizlashi mumkin bo'lgan fermentdir.Tabiatda 5 xil fosfolipaza mavjud, ya'ni fosfolipaza A2 va fosfolipaza
A., fosfolipaz B, fosfolipaza C va fosfolipaz D. Ilon zahari asosan fosfolipaz A2 (PLA2), bir nechta ilon zahari fosfolipaz B, boshqa fosfolipazalar asosan hayvon toʻqimalarida va bakteriyalarda uchraydi.3-11-4-rasmda bu fosfolipazlarning substrat gidroliziga ta'sir qilish joyi ko'rsatilgan.
Fosfolipazalar orasida PLA2 ko'proq o'rganilgan.Bu ilon zaharidagi eng ko'p o'rganilgan ferment bo'lishi mumkin.Uning substrati Sn-3-glitserofosfatning ikkinchi holatidagi ester bog'idir.Bu ferment ilon zahari, ari zahari, chayon zahari va hayvon to'qimalarida keng tarqalgan va PLA2 to'rtta oila ilon zaharida ko'p.Ushbu ferment qizil qon hujayralarini parchalab, gemolizga olib kelganligi sababli, u "gemolizin" deb ham ataladi.Ba'zi odamlar PLA2 gemolitik lesitinazni ham chaqirishadi.
Ludeeke birinchi bo'lib ilon zahari fermentlar orqali lesitinga ta'sir qilib, gemolitik birikma hosil qilishi mumkinligini aniqladi.Keyinchalik, Delezenne va boshqalar.kobra zahari ot zardobi yoki sarig'iga ta'sir qilganda gemolitik modda hosil qilishini isbotladi.Hozirgi vaqtda ma'lumki, PLA2 eritrotsitlar membranasining fosfolipidlariga to'g'ridan-to'g'ri ta'sir qilib, eritrotsitlar membranasining tuzilishini buzadi va to'g'ridan-to'g'ri gemolizga olib keladi;Shuningdek, u bilvosita gemolizni hosil qilish uchun qizil qon hujayralariga ta'sir qiluvchi gemolitik lesitin ishlab chiqarish uchun sarum yoki qo'shilgan lesitinga ta'sir qilishi mumkin.PLA2 ilon zaharlarining to'rtta oilasida ko'p bo'lsa-da, turli xil ilon zaharlaridagi fermentlarning tarkibi biroz farq qiladi.Rattlesnake (C
Ilon zahari faqat zaif PLA2 faolligini ko'rsatdi.3-11-11-jadvalda Xitoydagi zaharli ilonlarning 10 ta asosiy zaharlarining PLA2 faolligini taqqoslash ko'rsatilgan.
3-11-11-jadval Xitoyda 10 ta ilon zaharining fosfolipaza VIII faolligini taqqoslash
Ilon zahari
Yog 'ajratish
Alifatik kislota,
Cjumol/mg)
Gemolitik faollik CHU50/^ g * ml)
Ilon zahari
Yog 'kislotalarini chiqaring
(^raol/mg)
Gemolitik faollik "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
o'n bir
Mikrasefal ophis
besh nuqta bir nol
kalyspallas
8. 68
ikki ming sakkiz yuz
gracilis
V, o'tkir
7. 56
* * #
Ofiyofag Xanna
uch ball sakkiz ikki
bir yuz qirq
Bnugarus fasctatus
7,56
ikki yuz sakson
B. multicinctus
bir nuqta to'qqiz olti
ikki yuz sakson
Viper va russelli
yetti nuqta nol uch
T, mukrosquamatus
bir ball sakkiz besh
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Ajratish va tozalash
Ilon zaharidagi PLA2 ning miqdori katta va u issiqlik, kislota, gidroksidi va denaturantga chidamli bo'lib, PLA2 ni tozalash va ajratish oson.Umumiy usul - avval xom zaharda gel filtratsiyasini o'tkazish, so'ngra ion almashinuvi xromatografiyasini o'tkazish va keyingi bosqichni takrorlash mumkin.Shuni ta'kidlash kerakki, ion almashinadigan xromatografiyadan so'ng PLA2 ning muzlatish bilan quritilishi agregatsiyaga olib kelmasligi kerak, chunki muzlatish bilan quritish jarayoni ko'pincha tizimdagi ion kuchini oshiradi, bu PLA2 agregatsiyasini keltirib chiqaradigan muhim omil hisoblanadi.Yuqoridagi umumiy usullardan tashqari, quyidagi usullar ham qabul qilingan: ① Wells va boshqalar.② PLA2 ning substrat analogi yaqinlik xromatografiyasi uchun ligand sifatida ishlatilgan.Bu ligand Ca2+ bilan ilon zaharidagi PLA2 bilan bog'lanishi mumkin.EDTA asosan eluent sifatida ishlatiladi.Ca2+ chiqarilgandan so'ng, PLA2 va ligand o'rtasidagi yaqinlik pasayadi va uni liganddan ajratish mumkin.Boshqalar esa 30% organik eritma yoki 6mol/L karbamiddan eliminant sifatida foydalanadilar.③ PheiilSephar0SeCL-4B yordamida kardiotoksindagi PLA2 izini olib tashlash uchun gidrofobik xromatografiya o'tkazildi.④ Anti PLA2 antikori PLA2 da yaqinlik xromatografiyasini o'tkazish uchun ligand sifatida ishlatilgan.
Hozirgacha ko'p sonli ilon zahari PLAZ tozalandi.Tu va boshqalar.(1977) 1975 yilgacha ilon zaharidan tozalangan PLA2 sanab o'tgan. So'nggi yillarda har yili PLA2 ni ajratish va tozalash haqida ko'plab maqolalar e'lon qilinmoqda.Bu erda biz xitoylik olimlar tomonidan PLAni ajratish va tozalashga e'tibor qaratamiz.
Chen Yuancong va boshqalar.(1981) Zhejiangdagi Agkistrodon halys Pallas zaharidan uchta PLA2 turini ajratib oldi, ular izoelektrik nuqtalariga ko'ra kislotali, neytral va gidroksidi PLA2 ga bo'linishi mumkin.Uning toksikligiga ko'ra, neytral PLA2 ko'proq zaharli bo'lib, u presinaptik neyrotoksin Agkistrodotoksin sifatida aniqlangan.Ishqoriy PLA2 kamroq zaharli, kislotali PLA2 esa deyarli zaharli emas.Wu Xiangfu va boshqalar.(1984) uchta PLA2 xususiyatlarini, jumladan molekulyar og'irlik, aminokislotalar tarkibi, N-terminal, izoelektrik nuqta, termal barqarorlik, ferment faolligi, toksiklik va gemolitik faollikni solishtirdi.Natijalar shuni ko'rsatdiki, ular o'xshash molekulyar og'irlik va termal barqarorlikka ega, ammo boshqa jihatlarda sezilarli farqlarga ega.Ferment faolligi nuqtai nazaridan kislota fermenti faolligi ishqoriy ferment faolligidan yuqori edi;Ishqoriy fermentning kalamushning qizil qon hujayralariga gemolitik ta'siri eng kuchli edi, undan keyin neytral ferment va kislota fermenti deyarli gemolizlanadi.Shuning uchun PLAZ ning gemolitik ta'siri PLA2 molekulasining zaryadi bilan bog'liq deb taxmin qilinadi.Chjan Jingkang va boshqalar.(1981) Agkistrodotoksin kristallarini yaratdilar.Tu Guangliang va boshqalar.(1983) izoelektrik nuqtasi 7.6 bo'lgan zaharli PLA ning Fujiandagi Vipera rotundus zahridan ajratilgan va tozalanganligi va uning fizik va kimyoviy xossalari, aminokislotalar tarkibi va N. -terminal aniqlandi.Li Yuesheng va boshqalar.(1985) Fujiandagi Viper rotundus zaharidan yana bir PLA2 ni ajratib oldi va tozaladi.PLA2 * sub birligi 13 800, izoelektrik nuqtasi 10,4 va o'ziga xos faollik 35 / xnioI / miri mg。 Substrat sifatida lesitin bilan fermentning optimal pH qiymati 8,0 va optimal harorat 65 ° C ni tashkil qiladi. LD5 sichqonlarga tomir ichiga yuboriladi.Bu 0,5 ± 0,12 mg / kg ni tashkil qiladi.Bu ferment aniq antikoagulyant va gemolitik ta'sirga ega.Zaharli PLA2 molekulasi 18 turdagi aminokislotalarning 123 ta qoldig'idan iborat.Molekula sistein (14), aspartik kislota (14) va glitsinga (12) boy, lekin faqat bitta metioninni o'z ichiga oladi va uning N-terminali serin qoldig'idir.Tuguang tomonidan ajratilgan PLA2 bilan solishtirganda, molekulyar og'irlik va ikkita izoenzimning aminokislota qoldiqlari soni juda o'xshash va aminokislotalar tarkibi ham juda o'xshash, ammo aspartik kislota va prolin qoldiqlari soni biroz farq qiladi.Guangxi qiroli kobra ilon zahari PLA2 ga boy.Shu Yuyan va boshqalar.(1989) zahardan PLA2 ni ajratib oldi, uning o'ziga xos faolligi dastlabki zahardan 3,6 baravar yuqori, molekulyar og'irligi 13000, tarkibi 122 aminokislota qoldig'i, izoelektrik nuqtasi 8,9 va yaxshi issiqlik barqarorligi.Elektron mikroskopning asosiy PLA2 ning qizil qon tanachalariga ta'sirini kuzatishdan ko'rinib turibdiki, u inson qizil qon hujayralari membranasiga aniq ta'sir qiladi, ammo echki qizil qon hujayralariga aniq ta'sir ko'rsatmaydi.Ushbu PLA2 odamlarda, echkilarda, quyonlarda va gvineya cho'chqalarida qizil qon hujayralarining elektroforetik tezligiga aniq sekinlashtiruvchi ta'sir ko'rsatadi.Chen va boshqalar.Ushbu ferment ADP, kollagen va natriy araxidon kislotasi tomonidan qo'zg'atilgan trombotsitlar agregatsiyasini inhibe qilishi mumkin.PLA2 kontsentratsiyasi 10/xg/ml~lOOjug/ml bo'lsa, trombotsitlar agregatsiyasi butunlay inhibe qilinadi.Agar yuvilgan trombotsitlar material sifatida ishlatilsa, PLA2 20Mg / ml konsentratsiyasida agregatsiyani inhibe qila olmaydi.Aspirin sikloksigenaza inhibitori bo'lib, PLA2 ning trombotsitlarga ta'sirini inhibe qilishi mumkin.PLA2 tromboksan A2 ni sintez qilish uchun araxidon kislotasini gidrolizlash orqali trombotsitlar agregatsiyasini inhibe qilishi mumkin.Zhejiang provintsiyasida joylashgan Agkistrodon halys Pallas zahari tomonidan ishlab chiqarilgan PLA2 ning eritma konformatsiyasi dumaloq dikroizm, floresans va UV singdirish orqali o'rganildi.Eksperimental natijalar shuni ko'rsatdiki, bu fermentning asosiy zanjir konformatsiyasi boshqa tur va nasldagi bir xil turdagi fermentga o'xshash, skeletning konformatsiyasi yaxshi issiqlikka chidamli va kislotali muhitdagi strukturaviy o'zgarish teskari edi.Aktivator Ca2+ va fermentning birikmasi triptofan qoldiqlari muhitiga ta'sir qilmaydi, Zn2+ inhibitori esa aksincha.Eritmaning pH qiymatining ferment faolligiga ta'sir qilish usuli yuqoridagi reagentlardan farq qiladi.
Ilon zaharini PLA2 bilan tozalash jarayonida ilon zahari ikki yoki undan ortiq PLA2 elutsiya cho'qqilarini o'z ichiga olishi aniq hodisa.Bu hodisani quyidagicha izohlash mumkin: ① izozimlarning mavjudligi tufayli;② PLA2 ning bir turi turli molekulyar og'irliklarga ega bo'lgan turli xil PLA2 aralashmalariga polimerlanadi, ularning aksariyati 9 000 ~ 40 000 oralig'ida;③ PLA2 va boshqa ilon zahari komponentlarining kombinatsiyasi PLA2 ni murakkablashtiradi;④ PLA2 dagi amid bog'i gidrolizlanganligi sababli zaryad o'zgaradi.① Va ② keng tarqalgan, faqat bir nechta istisnolardan tashqari, CrWa/w ilon zaharidagi PLA2
Ikkita holat mavjud: ① va ②.Uchinchi holat PLA2 da quyidagi ilonlarning zaharida topilgan: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Falastin ilon, qum ilon va dahshatli ilon km。.
④ holatining natijasi elektroforez paytida PLA2 ning migratsiya tezligini o'zgartiradi, ammo aminokislotalar tarkibi o'zgarmaydi.Peptidlar gidroliz orqali parchalanishi mumkin, lekin odatda ular hali ham disulfid bog'lari bilan bog'lanadi.Sharqiy cho'chqa ilonining zahari PLA2 ning ikkita shaklini o'z ichiga oladi, ular mos ravishda a tipi va p tipi PLA2 deb ataladi.Ushbu ikki turdagi PLA2 o'rtasidagi farq faqat bitta aminokislotadir, ya'ni bir PLA2 molekulasidagi glutamin boshqa PLA2 molekulasidagi glutamik kislota bilan almashtiriladi.Ushbu farqning aniq sababi aniq bo'lmasa-da, odatda bu PLA2 ning dezaminatsiyasi bilan bog'liq deb ishoniladi.Agar Falastin ilonining zahari tarkibidagi PLA2 xom zahar bilan iliq bo'lsa, uning ferment molekulalarida oxirgi guruhlar avvalgidan ko'ra ko'proq bo'ladi.C dan ilon zaharidan ajratilgan PLA2 ikki xil N-terminalga ega va uning molekulyar og'irligi 30000. Bu hodisa PLA2 ning assimetrik dimeriga bog'liq bo'lishi mumkin, bu sharqiy olmosli ilon zaharidagi PLA2 tomonidan hosil bo'lgan simmetrik dimerga o'xshaydi. va g'arbiy olmosli ilon.Osiyo kobrasi ko'plab kichik turlardan iborat bo'lib, ularning ba'zilari tasniflashda unchalik aniq emas.Misol uchun, ilgari Kaspiy Kobrasi deb atalgan narsa endi tan olingan
Bu tashqi Kaspiy dengizi kobrasiga tegishli bo'lishi kerak.Ko'pgina kichik turlar mavjud va ular bir-biriga aralashganligi sababli, ilon zahari tarkibi turli manbalar tufayli juda farq qiladi va PLA2 izoenzimlarining tarkibi ham yuqori.Masalan, kobra zahari
r ^ ll turlarining kamida 9 turdagi PLA2 izozimlari, Kaspiy kobra kenja turi zaharida esa 7 xil PLA2 izoenzimlari topilgan.Durkin va boshqalar.(1981) turli xil ilon zaharlaridagi PLA2 tarkibini va izozimlar sonini, shu jumladan 18 ta kobra zahari, 3 ta mamba zahari, 5 ta ilon zahari, 16 ta ilon zahari va 3 ta dengiz iloni zaharini o'rgandi.Umuman olganda, kobra zaharining PLA2 faolligi yuqori, ko'plab izozimlarga ega.PLA2 faolligi va ilon zahari izozimlari o'rtacha.Mamba zahari va ilon zahari PLA2 faolligi juda past yoki PLA2 faolligi yo'q.Dengiz iloni zaharining PLA2 faolligi ham past.
So'nggi yillarda ilon zaharidagi PLA2 faol dimer shaklida mavjudligi haqida xabar berilmagan, masalan, sharqiy rombofora ilon (C. ilon zahari A va P tipidagi PLA2 ni o'z ichiga oladi, ikkalasi ham ikkita bir xil bo'linmalardan iborat. , va faqat dimeraza ega
Faoliyat.Shen va boshqalar.shuningdek, faqat ilon zahari PLA2 ning dimeri fermentning faol shakli ekanligini taklif qildi.Fazoviy tuzilmani o'rganish, shuningdek, g'arbiy olmosli ilonning PLA2 dimer shaklida mavjudligini isbotlaydi.Baliqxo'r birikma
Ilon zaharining ikki xil PLA ^ Ei va E2 mavjud bo'lib, ularda mín dimer shaklida mavjud, dimer faol va uning dissotsilangan monomeri faol emas.Lu Yinghua va boshqalar.(1980) E. Jayanthi va boshqalarning fizik-kimyoviy xossalari va reaksiya kinetikasini yanada oʻrgandi.(1989) ilon zaharidan asosiy PLA2 (VRVPL-V) ni ajratib oldi.PLA2 monomerining molekulyar og'irligi 10000 ni tashkil qiladi, bu o'limga qarshi, antikoagulyant va shish ta'siriga ega.Ferment PH 4,8 shartida turli molekulyar og'irlikdagi polimerlarni polimerlashi mumkin, polimerlanish darajasi va polimerlarning molekulyar og'irligi harorat oshishi bilan ortadi.96 ° C da hosil bo'lgan polimerning molekulyar og'irligi 53 100 ni tashkil qiladi va bu polimerning PLA2 faolligi ikkiga ortadi.
Yuborilgan vaqt: 2022 yil 18-noyabr